요약
98%의 정확도를 자랑하는 새로운 RNA 증폭 기술이 기존의 IHC 및 FISH 방식의 한계를 극복합니다. iFEN-tRCA 분석법은 실온에서 준비가 가능하며 1시간 내 10pM 이하의 낮은 농도에서도 높은 민감도로 HER2 바이오마커를 검출할 수 있습니다. 이 방법은 두 단계 반응을 통해 기존의 복잡한 절차와 긴 반응 시간을 단축하고, 보다 빠르고 효율적인 유방암 진단과 치료 모니터링이 가능하게 합니다. 독자들은 이 기술을 통해 진단 시간 및 비용 절감 효과뿐 아니라, 환자 맞춤형 치료 전략 수립을 위한 실질적인 이점을 누릴 수 있습니다.
기본 정보
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특허명: 표적 핵산을 검출하지 위한 iFEN-tRCA 분석 방법 및 이의 용도
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발명자: 김은정 교수
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출원번호: 10-2022-0002482
상세 정보
배경 기술
발명의 배경
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기존의 유방암 바이오마커 검출 방법인 IHC 염색은 감도가 낮고 위양성 결과가 나타날 수 있으며, CISH는 FISH에 비해 감도가 떨어짐.
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FISH는 시간이 오래 걸리고 형광이 퇴색되는 단점이 있으며, 침습적인 절차에 의존함.
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기존 영상 기술은 유방암 초기 단계 진단 및 모니터링에 효과적이지 않고, 유전자 발현 프로파일링은 비용과 시간이 많이 소요됨.
기술의 필요성
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HER2 표적 치료 모니터링 및 진단을 위한 새로운 방법이 필요하며, 새로운 질병 관련 염기서열에 적용 가능한 바이오마커 검출 기술이 요구됨.
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선택성과 민감성이 향상되고, 반응 시간이 단축되며, 추가적인 단계가 필요 없는 검출 방법이 필요함.
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1시간 이내에 10pM 미만의 검출 한계를 가지는 고효율의 바이오마커 검출 기술이 필요함.
구현 방법
기술의 원리
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iFEN-tRCA 분석 방법은 두 단계 반응, 즉 iFEN 반응과 tRCA 반응으로 구성됨. 표적 RNA는 두 개의 특이적 프라이머, InDNA와 ProDNA와 결합하여 독특한 가지형 DNA 구조를 형성함.
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FEN1 효소는 부분적으로 상보적인 결합을 한 ProDNA를 절단하여 FlapDNA와 cProDNA를 생성함. 이후, 덤벨 모양 주형 DNA(DB template), 형광 물질, DNA 중합효소를 이용하여 tRCA 반응을 통해 형광 신호를 증폭함.
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생성된 형광 신호의 강도를 측정하여 표적 RNA의 존재 유무 및 양을 정량적으로 분석함. 이 방법은 기존 방법보다 민감도와 특이도가 높고, 반응 시간이 짧으며, 추가적인 단계가 필요하지 않음.
구체적인 구현 방법
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먼저, 표적 핵산을 InDNA와 ProDNA 프라이머와 혼성화하여 가지형 DNA 구조를 만듬. 이 과정에서 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 두 프라이머의 역할이 중요함.
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다음으로, FEN1 엔도뉴클레아제를 이용하여 부분적으로 상보적으로 결합된 ProDNA를 절단함. 이때, FlapDNA와 cProDNA가 생성됨.
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절단된 ProDNA는 덤벨 모양의 주형 DNA(DB template), 형광 물질, 그리고 DNA 중합효소와 함께 반응하여 tRCA 반응을 유도함. 이 반응을 통해 형광 신호가 증폭됨.
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마지막으로, 형광 신호의 유무와 강도를 측정하여 표적 핵산의 유무와 양을 정확하게 판별함. 다양한 농도의 표적 RNA를 사용하여 검출 한계와 민감도를 평가함.
기술의 장점
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실온에서 반응 준비가 가능하여 편리함. 기존 방법 대비 민감도와 정확도가 향상되어 더욱 정확한 분석이 가능함.
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반응 시간이 짧아 분석 시간을 단축할 수 있음. annealing, ligation 등의 추가적인 단계가 필요 없어 효율적임.
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1시간 이내에 10pM 미만의 낮은 농도의 표적 RNA도 검출 가능할 정도로 민감도가 높음. HER2와 같은 유방암 관련 바이오마커 검출에 유용함.
실험 및 결과
실험의 목적
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iFEN-tRCA 분석법의 성능을 평가하고, 유방암 관련 바이오마커 검출 및 HER2 표적 치료 모니터링에 대한 적용 가능성을 확인함.
실험 방법 및 과정
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iFEN-tRCA 분석법을 이용하여 합성 및 추출 RNA를 대상으로 실험을 진행함. 두 개의 특이적 프라이머(InDNA 및 ProDNA), FEN1 엔도뉴클레아제, 덤벨 모양 주형 DNA(DB templates)를 사용함. RT, iFEN, tRCA 반응 단계를 거쳐 형광 신호 변화를 측정함.
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다양한 온도 조건에서 iFEN 및 tRCA 반응 최적화를 수행하고, toehold 길이가 tRCA 효율에 미치는 영향을 분석함. 또한, 다양한 농도의 표적 RNA에 대한 분석적 민감도와 특이도를 평가하고, 오류 염기서열의 영향을 확인함.
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실제 유방암 세포주(HCC1954, HCC1143)에서 추출한 RNA를 이용하여 iFEN-tRCA 분석을 수행하고, 양성 및 음성 대조군 (ERBB2, PPPP1R1B)과 비교 분석함. PAGE 분석을 통해 RT 반응에서 생성된 cDNA의 형성 및 효율을 확인함.
실험 결과
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iFEN-tRCA 분석법은 실온에서 반응 준비가 가능하며, 1시간 내 10pM 미만의 검출 한계를 보임. 높은 민감도와 특이도를 나타내며, 오류 염기서열에 대한 영향이 적음.
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합성 및 추출 RNA 모두에서 우수한 분석 성능을 보였으며, 양성 및 음성 대조군에서 명확한 차이를 확인함. PAGE 분석 결과 RT 반응의 효율이 확인됨.
활용 방안 및 기대효과
활용 방안
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HER2 표적 치료 모니터링 및 유방암 진단 도구로 사용될 수 있음
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새로운 질병 관련 염기서열 분석 및 바이오마커 검출에 적용 가능함
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다양한 바이오마커 단백질, DNA, RNA, 대사 물질 검출을 통한 질병 조기 진단 및 효과적 치료에 기여함
기대효과
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기존 IHC 염색, CISH, FISH 방식의 낮은 감도, 위양성 결과, 시간 소모 등의 단점을 극복함
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실온에서 반응 준비 가능하며, 2단계 반응으로 민감도와 정확도를 향상시켜 1시간 내 10pM 미만 검출 한계를 달성함
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선택성 및 민감성 향상, 반응 시간 단축, 추가 단계 불필요 등의 장점으로 효율성을 높임
시장 동향
iFEN-tRCA 분석 방법의 시장 동향
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iFEN-tRCA 분석 방법은 기존 방법 대비 민감도와 정확도가 개선되어 10pM 미만의 표적 핵산을 검출할 수 있음. 유방암 등 다양한 질병의 바이오마커 검출에 활용 가능성이 높아 관련 시장 성장 예상.[웹 출처]
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HER2 표적 치료 등 맞춤형 치료에 대한 모니터링 및 진단 도구로서 iFEN-tRCA 분석 방법의 활용 가능성 높음. 정밀 의학 시장의 성장에 따라 관련 진단 기술 수요도 증가 예상.[웹 출처]
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iFEN-tRCA 분석 방법은 등온 조건에서 수행되며, 1시간 이내에 결과를 얻을 수 있어 신속한 진단이 가능. COVID-19 팬데믹 이후 현장진단(Point-of-Care) 시장의 성장으로 인해 등온 증폭 기술의 수요 증가 예상.[웹 출처]
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세척 단계나 효소 비활성화 단계가 없는 균질한 2단계 반응으로 구성되어 있어 효율적이고 경제적인 진단이 가능. 의료비용 절감 및 진단 접근성 향상을 위한 기술로 주목받을 것으로 전망.[웹 출처]
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단일 염기 다형성(SNP) 등 유전자 변이를 정확하게 검출하여 유전성 질환의 진단에 활용. 산전 진단이나 신생아 선별검사 등에 적용하여 조기 진단 및 치료에 기여 가능.[웹 출처]
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